Формирование экспериментальных групп животных; простая и стратифицированная рандомизация.

Способ 1 основан на широко распространенном в России мнении: «Наше лекарство будут принимать совершенно разные люди и врач обязан назначать лечение всем обратившимся пациентам. Поэтому мы и в доклинических исследованиях должны использовать беспородных животных». Этот подход предполагает использование простой рандомизации.

Простая рандомизация - равновероятное распределение испытуемых в группы, без учета их специфики (аналогично подбрасыванию монетки). Так, в случае, если имеются две группы — основная и контрольная, вероятность попадания индивида в группу лечения равна вероятности попадания в группу контроля (50%). В этом случае возможно возникновение дисбаланса групп по возрасту, полу, тяжести заболевания, сопутствующей патологии и другим признакам.

Наиболее уместный случай применения простой рандомизации животных в психофармакологии - это использование особей с искусственно сниженной вариабельностью, то есть генетических линий * (не стоков ** !). Однако, необходимо учитывать, что сходство генотипов еще не означает автоматического сходства эндофенотипов и поведения (например, в любой группе мышей имеется иерархия, соответственно, часть особей подвергается ранговому стрессу).

Способ 2 основан на следующих рассуждениях: «Врач не работает с выборками, поскольку каждому пациенту индивидуально подбирает лекарство (а задача психофармакологии - пополнение арсенала лекарственных средств). С выборками работают специалисты в области клинических испытаний, которые исследуют один и тот же препарат на группе испытуемых». В этом случае важнейшую роль приобретает метод формирования «опытной» и «контрольной» групп. Этот подход предполагает использование стратифицированной рандомизации.

Стратифицированную рандомизацию применяют для избежания негативных последствий простой рандомизации. Стратификация обеспечивает распределение испытуемых по группам лечения с учетом факторов, существенно влияющих на исход испытания и гарантирует равномерное распределение указанных факторов в группах. При стратифицированной рандомизации учитывается один или несколько (обычно не больше двух) важных признаков («страт»), которые (по предварительным данным) могут существенно повлиять на результаты лечения, а, следовательно, должны быть равномерно распределены между группами. Такими признаками могут быть пол, возраст, основной диагноз, основной препарат базовой (неисследуемой) терапии, тяжесть состояния при поступлении и т.д. Это необходимо для того, чтобы все формируемые отдельные выборки были максимально похожи по составу на общую выборку испытуемых данного исследования.

В доклинических исследованиях для вычленения страт принято проводить предварительное тестирование всех животных по тому признаку, который по литературе или собственным данным может быть существенным для дальнейшего эксперимента. Поскольку большинство экспериментов проводятся на молодых здоровых животных одного пола, в качестве основного признака чаще всего используют уровень эмоционально-поведенческой реактивности. Именно этот фактор определяет реакцию животного на новизну.

В ряде случаев (обычно при углубленном изучении механизма действия препарата) целесообразно использовать для типирования животных и последующей рандомизации более стрессорную «нагрузку», чем в реальном эксперименте).

Как сформировать экспериментальные группы используя стратифицированную рандомизацию?

Часто анализ результатов предварительного тестирования животных указывает на то, что получившаяся выборка по значимому признаку имеет асимметричное или полимодальное распределение. В этом случае уместно присвоить каждому животному свой условный «коэффициент» и провести стратифицированную рандомизацию, сформировав экспериментальные группы с одинаковым числом особей, имеющих равные коэффициенты. Подобная процедура позволит избежать ложно-положительного или ложно-отрицательного результата, а также позволит ввести в эксперимент «крайние» типы выраженности признака. Далее исследователь будет решать, насколько уместно обсчитывать результаты с учетом животных, имеющих «крайний» тип выраженности признака по пре-тесту, или вообще не учитывать их при статистической обработке полученных результатов. Однако, внимательное отношение к таким животным, их отклику на препарат и условия тестирования, может навести исследователя на мысли о специальном формировании экспериментальных групп, состоящих из «крайних» типов. Такие исследования могут дать дополнительную информацию для понимания не только индивидуальной чувствительности к потенциальному лекарственному средству, но и его механизма действия.

Применение стратифицированной рандомизации не целесообразно в ряде случаев, когда предварительное тестирование выявляет качественный (чаще бинарный *** – есть/нет) отклик на наше воздействие. Например, животные, которые:

- поднырнули в Тесте «экстраполяционное избавление» / не поднырнули за определенное время; перед подныриванием совершали / или не совершали попытки выпрыгнуть вверх из цилиндра; - вышли в освещенную арену из убежища / не вышли; - характеризовались агрессией на захват рукой / были неагрессивны и т.п.

Поскольку качественные различия чаще всего имеют под собой серьезные различия генотипа или эндофенотипа, при их обнаружении более информативным является формирование двух полноценных групп для параллельного исследования.

Как выбрать пре-тест ?

При работе с животными необходимо учитывать, что крысы и мыши запоминают «что-где-когда и в каком порядке», то есть имеют аналог эпизодической памяти человека. Поэтому вынимание из клетки, «прогон» через ряд экспериментальных установок и возвращение обратно в жилую клетку для животного эквивалентен «путешествию туда и обратно». С одной стороны, благополучный возврат к сородичам в жилую клетку может быть положительным подкреплением и способствовать формированию «выученной уверенности» (или «иммунизации против стресса»). С другой стороны, животное может приобрести негативный опыт и выработать условно-эмоциональную реакцию на процедуру или условия тестирования.

ВАЖНО! Во многих случаях повторная посадка животного в одни и те же условия приводит к искажению результатов эксперимента.

Так, широко известно, что адаптация животных к условиям тестирования влияет на эффект исследуемых препаратов. Например, бензодиазепиновые транквилизаторы увеличивают время, проведенное животными на открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ). Однако, предварительная адаптация животных к условиям ПКЛ (достаточно одной посадки) приводит к исчезновению эффекта транквилизаторов [File SE, Zangrossi H Jr, Viana M, Graeff FG / Trial 2 in the elevated plus-maze: a different form of fear? / Psychopharmacology (Berl), 1993;111(4):491-4].

Для избежания указанных выше проблем, во многих случаях для типирования животных по уровню эмоционально-поведенческой реактивности удобно использовать реакцию животных на процедуры, которые неизбежно должны быть проведены перед началом эксперимента (взятие в руки, метка, укол, пересадка в новую клетку). Для этого необходимо проводить видеозапись всего эксперимента, включая все манипуляции. В качестве примера приводим тест взаимодействия животного с экспериментатором, осуществляющим хэндлинг [Gouveia K,Hurst JL. / Reducing mouse anxiety during handling: effect of experience with handling tunnels. / PloS One, 2013; 20;8(6)]

Кроме того, применяют и специальное предварительное тестирование (пре-тест). Как показали многочисленные исследования, использование в качестве пре-теста одного из тестов («открытое поле», «темно/светлая камера» или «темная камера с отверстиями»), обычно не влияет на поведение животных в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», при этом имеется корреляция между поведением животных в условиях пре-теста и теста. Например, животные, часто посещающие центральную зону открытого поля, проводят больше времени и на отрытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта [Alicia A Walf, Cheryl A Frye / The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents / Nature Protocols, 2007;2,322–328].

Существует общее правило выбора пре-теста: он не должен быть более стрессогенным, чем сам тест. Например, по этой причине тест «неизбегаемое плавание» не используют в качестве пре-теста для теста «открытое поле». В то же время, тест «открытое поле» используют достаточно часто в качестве пре-теста для теста «неизбегаемое плавание». Избегают и таких сочетаний тест/пре-тест, при которых изменение мотивационного фона может привести к нарушению обучение (например, пре-тест - «неизбегаемое плавание» и тест - «водный лабиринт Морриса»).

В заключение, заостряем внимание всех читателей на необходимости предварительного поиска литературы на предмет выявления корреляций между выбранным пре-тестом и основным воздействием. В качестве примера приводим следующие работы:

Bush DE, Vaccarino FJ. / Individual differences in elevated plus-maze exploration predicted progressive-ratio cocaine self-administration break points in Wistar rats. / Psychopharmacology (Berl). 2007; 194 (2):211-9.

Bahi A. / Individual differences in elevated plus-maze exploration predicted higher ethanol consumption and preference in outbred mice. / Pharmacol Biochem Behav. 2013; 105:83-8.

-----------

* линия (strain) – группа инбредных животных, в которой все ее члены генетически идентичны в максимально возможной степени; группа создана путем братско-сестринских скрещиваний в течение как минимум 20 поколений.

** сток (stock) – группа аутбредных животных с максимально высоким уровнем гетерозиготности; группа получена при менее 1% близкородственных скрещиваний в поколении и содержалась в закрытой колонии в течение как минимум 4-х поколений.

*** Бинарный отклик - это отклик, принимающий лишь 2 значения, или сводимый к таковым.